Phospho-Smad1/2/3/5 (Ser 423–Ser 467)
目录号: F2846
本抗体能够识别磷酸化后的 Smad1 (Ser 463/465)+Smad2 (Ser 465/467)+Smad3 (Ser 423/425)+Smad5 (Ser 463/465)。
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A549
Lane 2: A549 (TGF-ß1, 5ng/ml, 24h)
Lane 3: A549 (TGF-ß1, 5ng/ml, 24h; alkaline phosphatase treated)
操作要点
蛋白定位：细胞质, 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议一抗稀释比 1:2000。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议一抗稀释比 1:2000。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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48 kDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Smad3 (Ser 423/Ser 425) Rabbit mAb 用于检测当 Ser 423/425 位点磷酸化时内源性 Phospho-Smad3 (Ser 423/Ser 425) 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| Phospho-Smad3 (Ser 423/425)+Smad5 (Ser 463/465)+Smad1 (Ser 463/465)+Smad2 (Ser 465/467) |
| 克隆号 |
|---|
| L3N2 |
| 背景 |
|---|
| Phospho-Smad3 (Ser 423/Ser 425)是Smad3在其C端的两个关键丝氨酸残基的磷酸化形式，对TGF-β信号传导至关重要。在TGF-β激活后，I型受体激酶（TβRI）在Ser 423和Ser 425位点磷酸化Smad3，诱导构象变化，使其与受体复合物分离。这一磷酸化事件使Smad3与Smad4形成异源复合物，转移到细胞核，调节参与细胞过程的靶基因的转录，如增殖、分化、凋亡和免疫调节。Ser 423/Ser 425的磷酸化增强了Smad3的稳定性和转录活性，使其能够与共激活因子如CBP和p300相互作用，精确调节基因表达。磷酸化Smad3的失调会通过改变TGF-β信号传导动态，导致如纤维化、免疫障碍和肿瘤进展等病理状况。 |
| 参考文献 |
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