Phospho-Src Family (Tyr416) Rabbit mAb

目录号: F0304

Lane 1: NIH/3T3 (hPDGF-BB,100 ng/ml,15min)
Lane 2: NIH/3T3 (serum-starved)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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客户使用Selleck的Phospho-Src Family (Tyr416) Rabbit mAb发表文献1篇

操作要点

蛋白定位：细胞膜; 细胞质; 细胞骨架; 内膜。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

抗体类型
Rabbit

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
60 kDa

阳性对照	NIH/3T3 (serum-starved + treated with hPDGF-BB, 100 ng/ml, 15 min)
阴性对照	NIH/3T3

样品处理数据示例

样品	处理情况
NIH/3T3	Serum-starvation + hPDGF-BB (100 ng/mL, 15 min)
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^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95–100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭（可选） 1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95–100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭（可选）

1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
仅当 Tyr416 位点发生磷酸化时，Phospho-Src Family (Tyr416) Rabbit mAb 才可检测内源性总 Phospho-Src 的蛋白水平。

别名
YES, LYN, LSK, HCK,SRC, SLK

Uniprot ID
P07947, P07948, P06239, P08631, P12931, P06241

克隆号
H4N15

背景
Src 蛋白酪氨酸激酶家族包括 Src、Lyn、Fyn、Yes、Lck、Blk 和 Hck，在调控真核细胞的生长和分化方面起着至关重要的作用。Src 由多种细胞外信号激活，包括整合素、G 蛋白偶联受体、类固醇受体和受体酪氨酸激酶 (RTK)，例如血小板衍生的生长因子受体 (PDGFR)、表皮生长因子受体 (EGFR) 家族、成纤维细胞生长因子受体 (FGFR)、胰岛素样生长因子-1 受体 (IGF-1R)、c-Met、集落刺激因子-1 受体 (CSF-1R) 和干细胞因子受体 (SCFR) 等。 Src 活性受两个关键酪氨酸残基的磷酸化调控，这两个残基具有相反的作用：激酶结构域活化环中 Tyr416 的磷酸化可增强 Src 活性，而 C 末端 Src 激酶 (Csk) 对 C 末端尾部 Tyr527 的磷酸化可抑制 Src 活性。

背景

Src 蛋白酪氨酸激酶家族包括 Src、Lyn、Fyn、Yes、Lck、Blk 和 Hck，在调控真核细胞的生长和分化方面起着至关重要的作用。Src 由多种细胞外信号激活，包括整合素、G 蛋白偶联受体、类固醇受体和受体酪氨酸激酶 (RTK)，例如血小板衍生的生长因子受体 (PDGFR)、表皮生长因子受体 (EGFR) 家族、成纤维细胞生长因子受体 (FGFR)、胰岛素样生长因子-1 受体 (IGF-1R)、c-Met、集落刺激因子-1 受体 (CSF-1R) 和干细胞因子受体 (SCFR) 等。 Src 活性受两个关键酪氨酸残基的磷酸化调控，这两个残基具有相反的作用：激酶结构域活化环中 Tyr416 的磷酸化可增强 Src 活性，而 C 末端 Src 激酶 (Csk) 对 C 末端尾部 Tyr527 的磷酸化可抑制 Src 活性。

参考文献
[1] Pelaz SG, et al. Oncogene. 2022 Nov;41(45):4917-4928. [2] Hunter T. Cell. 1987 Apr 10;49(1):1-4.

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%