Phospho-TRAF2 (Ser11) Rabbit mAb

目录号: F1348

    • Lane 1: THP-1(TPA, 80 nM, overnight)
      Lane 2: THP-1(TPA, 80 nM, overnight; transfect poly(dA:dT), 0.004 U/ml, 7 hrs)
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    操作要点

    蛋白定位:细胞质
    WB
    建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    抗体应用
    WB
    抗体类型
    Rabbit
    反应性
    Human, Mouse
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
    储存条件(自收到货起)
    –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    53 kDa
    阳性对照 THP-1 ( poly (dA:dT), 0.004 U/ml, 7h )
    阴性对照

    样品处理数据示例

    样品 处理情况
    THP-1 TPA (80 nM, overnight)
    THP-1 TPA (80 nM, overnight)+ poly(dA:dT) (0.004 U/mL; 7r ),
    THP-1 TPA (80 nM, overnight)+LPS (1μg/mL, 0.25/1 h)
    点击查看更多样品数据

    *该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考:http://www.proteinatlas.org

    实验方法

    WB
    Western Blotting
     
    样品制备
    1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
    2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
    3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
    4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
    5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
    6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
    7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
     
    膜封闭与抗体孵育
    a. 封闭
    1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
    2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
    3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
     
    b. 抗体孵育
    1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
    2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
    3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
    4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
    5. 进行检测。
     
    显影检测
    1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
    2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
    3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
    WB
    实验步骤:
     
    样品制备
    1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF, Phosphatase Inhibitor),低温匀浆。
    2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF, Phosphatase Inhibitor),冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF, Phosphatase Inhibitor),冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
    6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
     
    转膜
    1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜)。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件:200 mA, 120 min。(电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
     
    封闭
    1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
    2. 在封闭液(建议使用 5% BSA溶液)中将膜孵育 1 h,室温;
    3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:1000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
    2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
    3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
    4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
    2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性

    Phospho-TRAF2 (Ser11) Rabbit mAb 仅当 Ser11 位点磷酸化时才检测内源性总 TRAF2 的蛋白水平。

    Uniprot ID
    Q12933
    克隆号
    L10C17
    背景

    " TRAF2(TNF 受体相关因子 2)是 TRAF 家族中的关键接头蛋白,可调控来自 TNFR 超家族成员(包括 TNF-α 和 CD40)的信号。TRAF2 在丝氨酸 11 处的磷酸化由 TANK 结合激酶 1 (TBK1) 等激酶介导,对于下游 JNK 和 NF-κB 信号通路的激活至关重要。这种磷酸化促进 TRAF2 的细胞质易位,干扰其 RING 结构域与磷脂的相互作用,并且是完全激活 JNK 通路和 NF-κB 通路的第二阶段所必需的。在功能上,TRAF2 磷酸化增强 c-Jun 和 NF-κB 活性并赋予对应激诱导的细胞凋亡,使其成为癌症的潜在治疗靶点,其中改变的 TRAF2 信号传导会导致肿瘤发生和疾病进展。”"

    参考文献

    技术支持

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