A2M Antibody (Rabbit mAb) [N15F12]
目录号: F5599
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, ELISA, ChIP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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163 kDa
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| 阳性对照 | Human placenta tissue; Mouse kidney tissue; Rat lung tissue |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| A2M Antibody (Rabbit mAb) [N15F12] 可检测内源性 A2M 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| P01023 |
| 克隆号 |
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| N15F12 |
| 别名 |
|---|
| Alpha 2 M; alpha-2-M; Alpha-2-M (A2M); alpha-2-macroglobulin; DKFZp779B086; middle region; A2m1; A2maa; A2MAC1; A2mb; A2MD; A2mp; CPAMD5; FWP007; Mam; S863-7 |
| 背景 |
|---|
| α2-巨球蛋白 (A2M) 是一种丰富的血浆蛋白酶抑制剂，它利用一种独特的物理捕获机制来中和蛋白酶，而非经典丝氨酸蛋白酶抑制剂所采用的活性位点阻断机制。这使得 A2M 能够抑制所有四大主要催化类别的蛋白酶，尽管它对任何特定的活性位点序列都没有特异性。这种捕获机制是由暴露的、无结构的 39 个氨基酸残基的“诱饵区”内的切割触发的，该区域极易被几乎所有蛋白酶水解；将该诱饵区完全改造为甘氨酸-丝氨酸重复序列后，A2M 仍保持完全的功能，并且不再能被任何测试的蛋白酶切割。这表明，特定的诱饵区序列本身对于 A2M 的整体抑制结构并非必需，其作用仅仅是提供一个易于切割的位点，而与序列组成无关。利用甘氨酸-丝氨酸“白板”诱饵区进行的结构分析表明，诱饵区的 C 端部分通常穿过天然 A2M 中的中心通道，而切割会使该片段从通道中缩回，从而破坏插入通道的排列；通过化学还原二硫键来延长诱饵区的二硫键环版本，可以使 A2M 保持其天然构象，而发生在完整二硫键环内的切割无法触发构象变化，直到二硫键也被还原，这些都表明，在诱饵区引入物理不连续性，而不是单独切割任何单个肽键，才是 A2M 大规模构象重排的特定触发因素。这种构象坍塌将捕获的蛋白酶物理性地包裹在A2M的结构内，在许多A2M同源物中，坍塌还会暴露一个内部的高活性硫酯键，该硫酯键将酶与A2M共价结合，进一步稳定复合物；被捕获的蛋白酶对小肽底物仍具有催化活性，但由于空间位阻而无法接近大蛋白底物，由此产生的蛋白酶-A2M复合物随后被巨噬细胞受体识别并清除。由于这种捕获机制能够容纳多种结构各异的蛋白酶，A2M作为细胞外蛋白水解的通用调节因子，参与包括血液凝固、炎症和组织重塑在内的多种过程，而A2M活性失调与从脓毒症到神经退行性淀粉样变性疾病等多种疾病相关。 |
| 参考文献 |
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