APE Antibody [F3K5]
目录号: F7629
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (KO APEX1), Lane 3: HCT116, Lane 4: NIH/3T3
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:100000
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:100000
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF, FCM, ChIP |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
实际分子量
|
|---|
|
35 kDa
35 kDa, 37 kDa
|
| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat liver tissue; Mouse liver tissue; Human ovarian cancer tissue; Human fetal brain tissue; Human fetal heart tissue; Human fetal kidney tissue; Human fetal spleen tissue; Mouse brain tissue; Mouse liver tissue; Rat brain tissue; Rat liver tissue; Rat spleen tissue; HCT 116 cells; HepG2 cells; HeLa cells; HAP1 cells; NIH/3T3 cells; C6 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
|
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| APE Antibody [F3K5] 可检测内源性 APE 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内质网，线粒体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P27695 |
| 克隆号 |
|---|
| F3K5 |
| 别名 |
|---|
| APE, APE1, APEX, APX, HAP1, REF1, APEX1, APEX nuclease, Apurinic-apyrimidinic endonuclease 1, Redox factor-1, APEN, AP endonuclease 1, APE-1, REF-1 |
| 背景 |
|---|
| 无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1（APE1，也称为APEX1或Ref-1）是哺乳动物细胞中主要的无碱基位点核酸内切酶，也是一种多功能核蛋白，它整合了碱基切除修复、转录因子的氧化还原调控以及更广泛的DNA损伤反应信号通路。该蛋白属于二价金属依赖性α/β磷酸酯酶超家族，其结构包含一个C端催化核心，该核心具有活性位点残基和柔性环，介导DNA结合、损伤识别和切口化学反应；此外，其独特的N端片段提供核靶向和与伴侣蛋白相互作用的界面，并调节定位和调控功能。 APE1 识别碱基切除修复或自发性碱基丢失过程中产生的无碱基位点，将损伤翻转至紧凑的活性位点口袋中，并切割无碱基核苷酸 5′ 端的磷酸二酯骨架，形成具有 3′-羟基和 5′-脱氧核糖磷酸末端的切口，这些末端适于后续由 DNA 聚合酶 β 进行缺口填充和连接，从而防止有毒 AP 位点和单链断裂的积累。该酶还通过 3′-修复二酯酶和 3′-核酸外切酶活性去除多种 3′-封闭基团，例如 3′-磷酸酯和 3′-磷酸乙醇酸酯，直接参与氧化和辐射损伤引起的 DNA 末端的修复，并促进多种修复途径的完成。 APE1 的额外核苷酸切口修复活性使其无需糖基化酶的预先作用即可直接切割某些氧化损伤的碱基，从而将其功能扩展到经典碱基切除修复 (BER) 之外，并将其与氧化嘌呤和嘧啶的替代修复途径联系起来。APE1 的 N 端区域具有氧化还原调节功能，它能将 AP-1、NF-κB、HIF-1α 等转录因子的关键半胱氨酸残基维持在还原态，从而促进 DNA 结合，进而将细胞氧化还原状态和 DNA 损伤与调控炎症、血管生成和应激适应的转录反应联系起来。APE1 与众多 DNA 修复和染色质相关蛋白相互作用，在 BER 相互作用组中形成一个中心枢纽，协调损伤识别、修复合成和染色质访问，并且还与 ATM/ATR 介导的检查点通路相互作用，使 APE1 成为基因毒性应激后基因组稳定性和细胞命运的调节因子。 APE1 表达、亚细胞分布和翻译后修饰的严格调控对于细胞活力至关重要；APE1 的缺失会导致小鼠胚胎死亡，并损害其对氧化和烷基化损伤的抵抗力；而异常的过表达、错误定位或活性改变则见于多种癌症和神经病理学，并与治疗耐药性和疾病易感性相关。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
