Anti-ITCH Rabbit Antibody [K4F16]

目录号: F0891

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: Ramos
Lane 2: Raji
Lane 3: NIH/3T3

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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客户使用该产品的实验数据

操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:200

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
105 kDa

阳性对照	Ramos; Raji; Daudi; NIH/3T3; MOLT-4; Hela (WT)
阴性对照	Hela (ITCH KO)

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-ITCH Rabbit Antibody [K4F16] 可检测内源性总 ITCH 的蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，胞内体，内膜，细胞核

Uniprot ID
Q96J02

克隆号
K4F16

别名
ITCH,AIP4

背景
ITCH 是一种含有 HECT 结构域的 E3 泛素连接酶，最初是在小鼠 Agouti 基因的遗传研究中发现的，该基因的突变会导致明显的皮毛颜色变化。有一种特殊的Agouti 基因突变，称为非致死性 Agouti 18H 突变，因其导致 Agouti 突变的小鼠发生免疫缺陷而受到关注。这种 18H 突变会导致皮毛颜色变深，通常是由辐射诱导的染色体倒位引起的，该倒位分别从近端和远端倒位断点删除了 18 个和 20 个碱基对，从而破坏了 Agouti 和 Itch 基因的表达。Itch 基因编码一种由 854 个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为 113 kDa。ITCH 是一种单体 E3 泛素连接酶，属于 HECT 型家族，其特征是模块化结构，包括 N 端 Ca2+ 依赖性磷脂结合 C2 结构域、多个参与蛋白质-蛋白质相互作用的 WW 结构域和 C 端 HECT 结构域。HECT 结构域与特定的 E2 泛素结合酶相互作用，并含有高度保守的半胱氨酸残基，该残基在将泛素转移到靶蛋白之前与泛素形成硫酯键。 ITCH 包含四个 WW 结构域和一个位于残基 195 和 246 之间的独特脯氨酸富集区 (PRR)，这在其调控功能中起着至关重要的作用。ITCH 介导的泛素化超出了免疫信号通路的范围，针对 Hedgehog、Wnt/β-catenin、Hippo 和 Notch 信号通路中的关键调控因子，对细胞信号传导具有广泛影响。

背景

ITCH 是一种含有 HECT 结构域的 E3 泛素连接酶，最初是在小鼠 Agouti 基因的遗传研究中发现的，该基因的突变会导致明显的皮毛颜色变化。有一种特殊的Agouti 基因突变，称为非致死性 Agouti 18H 突变，因其导致 Agouti 突变的小鼠发生免疫缺陷而受到关注。这种 18H 突变会导致皮毛颜色变深，通常是由辐射诱导的染色体倒位引起的，该倒位分别从近端和远端倒位断点删除了 18 个和 20 个碱基对，从而破坏了 Agouti 和 Itch 基因的表达。Itch 基因编码一种由 854 个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为 113 kDa。ITCH 是一种单体 E3 泛素连接酶，属于 HECT 型家族，其特征是模块化结构，包括 N 端 Ca2+ 依赖性磷脂结合 C2 结构域、多个参与蛋白质-蛋白质相互作用的 WW 结构域和 C 端 HECT 结构域。HECT 结构域与特定的 E2 泛素结合酶相互作用，并含有高度保守的半胱氨酸残基，该残基在将泛素转移到靶蛋白之前与泛素形成硫酯键。 ITCH 包含四个 WW 结构域和一个位于残基 195 和 246 之间的独特脯氨酸富集区 (PRR)，这在其调控功能中起着至关重要的作用。ITCH 介导的泛素化超出了免疫信号通路的范围，针对 Hedgehog、Wnt/β-catenin、Hippo 和 Notch 信号通路中的关键调控因子，对细胞信号传导具有广泛影响。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18552861/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%