Phospho-NF-B p105 (Ser932) Rabbit mAb

目录号: F0400

Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min)
Lane 3: NIH/3T3
Lane 4: NIH/3T3 (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
蛋白定位
细胞质；细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

抗体类型
Rabbit

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
120 kDa

阳性对照	HeLa (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min); NIH/3T3 (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min); Vero (TNF-α ,20 ng/ml, 5s); Vero (TNF-α ,20 ng/ml, 15s)
阴性对照

样品处理数据示例

样品	处理情况
Hela	TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min
NIH/3T3	TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min
Vero	TNF-α ,20 ng/ml, 5s
Vero	TNF-α ,20 ng/ml, 15s
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^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
Western Blotting 样品制备 1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。 2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。 3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。 4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。 5. 离心5分钟(使用微量离心机)。 6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。 7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 200mA 150min) 膜封闭与抗体孵育 a. 封闭 1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。 2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。 3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 b. 抗体孵育 1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。 2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。 4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 5. 进行检测。显影检测 1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。 2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。 3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Western Blotting

样品制备

1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。

2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。

3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。

4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。

5. 离心5分钟(使用微量离心机)。

6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。

7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 200mA 150min)

膜封闭与抗体孵育

a. 封闭

1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。

2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。

3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

b. 抗体孵育

1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。

2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。

4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

5. 进行检测。

显影检测

1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。

3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
仅当 Ser932 位点发生磷酸化时，Phospho-NF-B p105 (Ser932) Rabbit mAb 可检测内源性总 Phospho-NF-B p105 (Ser932) 的蛋白水平。

Uniprot ID
P19838

克隆号
H7P1

背景
NF-κB（核因子 κB）转录因子在调控免疫和炎症反应中起着重要作用。NF-κB（核因子 κB）/Rel 转录因子家族的两个成员 NF-κB1 和 NF-κB2 分别作为前体蛋白 NF-κB1 p105 和 NF-κB2 p100 产生。在 TNFα 刺激或 LPS 激活 TLR4 后，NF-κB p105 在 Ser932 位点被 IKK 复合物磷酸化。PEST 区域的这种磷酸化会募集 SCFβTrCP E3 连接酶，导致 p105 泛素化和蛋白酶体降解。p105 降解会释放 TPL-2，从而激活 MEK/ERK 信号通路。因此，NF-κB p105 在 Ser932 处的磷酸化可调控 NF-κB 活化和 MAP 激酶信号传导，通过控制淋巴细胞和巨噬细胞的功能来协调免疫和炎症反应。

背景

NF-κB（核因子 κB）转录因子在调控免疫和炎症反应中起着重要作用。NF-κB（核因子 κB）/Rel 转录因子家族的两个成员 NF-κB1 和 NF-κB2 分别作为前体蛋白 NF-κB1 p105 和 NF-κB2 p100 产生。在 TNFα 刺激或 LPS 激活 TLR4 后，NF-κB p105 在 Ser932 位点被 IKK 复合物磷酸化。PEST 区域的这种磷酸化会募集 SCFβTrCP E3 连接酶，导致 p105 泛素化和蛋白酶体降解。p105 降解会释放 TPL-2，从而激活 MEK/ERK 信号通路。因此，NF-κB p105 在 Ser932 处的磷酸化可调控 NF-κB 活化和 MAP 激酶信号传导，通过控制淋巴细胞和巨噬细胞的功能来协调免疫和炎症反应。

参考文献
[1] Beinke S, et al. Biochem J. 2004 Sep 1;382(Pt 2):393-409.

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