Phospho-NF-κB p105 (Ser 932) Rabbit mAb
目录号: F0400
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Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min)
Lane 3: NIH/3T3
Lane 4: NIH/3T3 (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min)
操作要点
蛋白定位：细胞质；细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 120 kDa |
| 阳性对照 | HeLa (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min); NIH/3T3 (TNF-α,20 ng/ml,5 min; Calyculin A,50 nM,5 min); Vero (TNF-α ,20 ng/ml, 5s); Vero (TNF-α ,20 ng/ml, 15s) |
|---|---|
| 阴性对照 |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 |
| Hela | TNF-α (20 ng/mL, 5 min) + Calyculin A (50 nM, 5 min) |
| NIH/3T3 | TNF-α (20 ng/mL, 5 min) + Calyculin A (50 nM, 5 min) |
| Vero | TNF-α (20 ng/mL, 5 s) |
| 点击查看更多样品数据 | |
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
仅当 Ser932 位点发生磷酸化时，Phospho-NF-B p105 (Ser932) Rabbit mAb 可检测内源性总 Phospho-NF-B p105 (Ser932) 的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P19838 |
| 克隆号 |
|---|
| H7P1 |
| 背景 |
|---|
NF-κB（核因子 κB）转录因子在调控免疫和炎症反应中起着重要作用。NF-κB（核因子 κB）/Rel 转录因子家族的两个成员 NF-κB1 和 NF-κB2 分别作为前体蛋白 NF-κB1 p105 和 NF-κB2 p100 产生。在 TNFα 刺激或 LPS 激活 TLR4 后，NF-κB p105 在 Ser932 位点被 IKK 复合物磷酸化。PEST 区域的这种磷酸化会募集 SCFβTrCP E3 连接酶，导致 p105 泛素化和蛋白酶体降解。p105 降解会释放 TPL-2，从而激活 MEK/ERK 信号通路。因此，NF-κB p105 在 Ser932 处的磷酸化可调控 NF-κB 活化和 MAP 激酶信号传导，通过控制淋巴细胞和巨噬细胞的功能来协调免疫和炎症反应。 |
| 参考文献 |
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