PLD2 Rabbit mAb

目录号: F1493

Filter:

Lane 1: Hela
Lane 2: A549
Lane 3: HUVEC
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F1493 at 1/100 dilution.

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

蛋白定位：细胞膜; 内膜。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

抗体类型
Rabbit

反应性
Human

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
95 kDa

阳性对照	human cortex; HeLa; A549; HUVEC
阴性对照

样品处理数据示例

样品	处理情况
293T	Tansfection (hPLD2-Myc)
点击查看更多样品数据

^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭（可选） 1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭（可选）

1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
PLD2 Rabbit mAb 可检测内源性总 PLD2 的蛋白水平。

Uniprot ID
O14939

克隆号
B7K12

背景
磷脂酰胆碱特异性磷脂酶 D (PLD) 催化磷脂酰胆碱 (PC) 水解生成胆碱和磷脂酸 (PA)，其中 PA 是第二信使二酰甘油 (DAG) 的前体。PLD 有两种主要同工型：PLD1 和 PLD2。PLD2 在基础条件下主要定位于质膜，在那里它与脂筏中的受体结合；而 PLD1 位于核周膜中，并在细胞刺激后转移到质膜。 PLD2 的激活由蛋白激酶 C (PKC) 和受体（例如 EGFR、PDGFR）和非受体酪氨酸激酶（例如 Src、JAK3）介导，而 PLD1 由 PKC、酪蛋白激酶 II 和小 GTP 酶（例如 ARF 和 RHO）激活。与 PLD1 相比，PLD2 表现出更高的基础活性，并且不仅作为磷脂酶发挥作用，而且作为鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 发挥作用。PLD2 活性通过复杂的磷酸化和去磷酸化途径进行调控，主要作用于酪氨酸残基，涉及与 S6K、Grb2、Sos、WASp 和 Rac2 等蛋白质的相互作用。PLD2 异构体在各种癌症中高度表达，包括结直肠癌和乳腺癌，并且还充当小 GTP 酶 Rac2 的 GEF，与其磷脂酶功能无关。

背景

磷脂酰胆碱特异性磷脂酶 D (PLD) 催化磷脂酰胆碱 (PC) 水解生成胆碱和磷脂酸 (PA)，其中 PA 是第二信使二酰甘油 (DAG) 的前体。PLD 有两种主要同工型：PLD1 和 PLD2。PLD2 在基础条件下主要定位于质膜，在那里它与脂筏中的受体结合；而 PLD1 位于核周膜中，并在细胞刺激后转移到质膜。 PLD2 的激活由蛋白激酶 C (PKC) 和受体（例如 EGFR、PDGFR）和非受体酪氨酸激酶（例如 Src、JAK3）介导，而 PLD1 由 PKC、酪蛋白激酶 II 和小 GTP 酶（例如 ARF 和 RHO）激活。与 PLD1 相比，PLD2 表现出更高的基础活性，并且不仅作为磷脂酶发挥作用，而且作为鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 发挥作用。PLD2 活性通过复杂的磷酸化和去磷酸化途径进行调控，主要作用于酪氨酸残基，涉及与 S6K、Grb2、Sos、WASp 和 Rac2 等蛋白质的相互作用。PLD2 异构体在各种癌症中高度表达，包括结直肠癌和乳腺癌，并且还充当小 GTP 酶 Rac2 的 GEF，与其磷脂酶功能无关。

参考文献
[1] Noble AR, et al. Br J Cancer. 2019 Dec;121(12):1016-1026.

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%